越来越多的资料表明,雌激素对精子功能起着重要的调节作用。精浆中或雌性生殖道内的雌激素浓度与精子活动力有一定的相关性,并且能够增强精子前向运动力、促进超激活运动的发生、增加精子活力甚至提高精子受精能力[1],但迄今为止,雌激素影响精子运动能力的相关机制还未阐明。本文拟采用计算机辅助精子检测系统和流式细胞术检测雌激素类物质17β雌二醇(E2)对正常人精子运动力的影响,并探讨其可能的作用机制。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂和仪器 17β雌二醇(E2)、雌二醇牛血清白蛋白交联物(E2BSA)、腺苷酸环化酶抑制剂(SQ22536),均购自Sigma公司;Ca2+荧光探针Fluo3/AM,购自Molecular Probe Inc公司;人血清白蛋白(HSA),购自成都蓉生药业有限公司;计算机辅助精子分析系统(CASA)为杭州麦迪公司产品,流式细胞仪(型号EPICS ELITEESP)为美国Coulter公司产品。 1.1.2 精液来源与处理 实验所用27例精液标本来自年龄25~40岁,身体健康有正常生育史的成年男性志愿者,其近期精液常规各项指标符合WHO制定的精液检查标准[2]。精液标本置于5%CO2孵箱孵育40min完全液化,用上游法获取活动良好的精子,用BWW低蛋白液调整精子密度至2×107/ml. 1.2 实验分组和方法 取15例上游精子悬液标本,将每例标本均分为4管,第1管为对照组,第2~4管中分别加入不同浓度E2(终浓度分别为0.01 μmol/L、0.1 μmol/L、10 μmol/L),置于5%CO2孵箱孵育30 min,随后用BWW低蛋白液离心洗涤2次(500×g,5 min/次),重悬精子至2×107/ml,采用计算机辅助精子分析系统检测精子前向运动百分率、平均曲线运动速度、平均直线运动速度和平均路径速度的变化,每份精子悬液观测8个视野。 另取12例上游精子悬液标本,每例标本均分为6组,第1管为对照组,第2~6管依次为E2组、E2+SQ22536组、E2BSA组、E2BSA+ SQ22536组、SQ22536组。首先在第3、5管中加入SQ22536(5 mmol/L),并与其余各管在5%CO2孵箱孵育40 min,BWW低蛋白液洗涤、重悬精子。随后在第2、3管中加入E2(0.1 μmol/L),第4、5管中加入E2BSA(5 μmol/L),第6管中加入SQ22536(5 mmol/L),各管均继续孵育15 min,500×g离心2次(5 min/次)。重悬精子后加入Ca2+荧光探针Fluo3/AM(终浓度3 μmol/L),5%CO2孵箱避光负载45 min,500×g离心5 min除去上清液,用无Ca2+、Mg2+的BWW蛋白液洗涤2次去除胞外游离的Fluo3/AM,重悬精子至1×106/ml,采用流式细胞术检测精子内的荧光强度值以反映精子胞内Ca2+浓度的变化。 1.3 统计学分析 实验数据均以x±s表示,用SPSS11.5统计学软件进行单因素方差分析及t检验评价组间差异,P
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