葛根为豆科植物柴葛Pueraria lobata (Willd. )Ohwi 和甘葛藤Pueraria thomsonii Bent h. 的干燥根，前者习称柴葛，甘葛藤习称“粉葛”［1］，始载于《神农本草经》，味甘、辛，性平，具有增加脑及冠状动脉血流量、降低血管阻力、收缩平滑肌、降血糖及解热等多种功效［2］。民间用于治疗伤寒、温热头痛、烦热消渴等症，也是中医常用的祛风解毒药。现代研究表明，葛根含葛根异黄酮，主要为葛根素(perarin) 、大豆苷(daidzin) 、大豆苷元(daidzein) 3种活性成分，其中葛根素是本属的特征成分，也是主要成分，为了对葛根进行有效的质量控制，本实验以葛根素为指标，以柴葛、粉葛药材为对象，建立了高效液相色谱法测定其葛根素的含量方法，并采用紫外分光光度法对其中的总黄酮进行了含量测定，为柴葛、粉葛的药材鉴定提供参考方法。　　1  仪器与材料　　1.1   仪器美国 Waters 公司600-2487高效液相色谱仪,Millenium数据处理系统;Waters2487紫外检测器；岛津UV-2401PC型紫外分光光度计；岛津AY120型万分之一电子分析天平；SB3200型超声清洗器。　　1.2   材料葛根素对照品：中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯；水为重蒸馏超纯水；其它试剂均为分析纯。柴葛产于安徽岳西，粉葛产于广西。　　2  方法与结果　　2.1  HPLC法测定葛根中葛根素的含量　　2.1.1  色谱条件色谱柱：Zorbax XDB-C18（4. 6 mm ×250 mm , 5 μm)；流动相∶甲醇-水（32∶68）；流速1 ml/min；检测波长250 nm；柱温22℃；进样体积10μl。理论板数按葛根素峰计算不低于5000。在该色谱条件下，样品中的葛根素与其它峰均能达到基线分离，保留时间在14.3 min左右，对照品与样品的色谱图见图1。　　图1  对照品Ⅰ、柴葛索氏提取Ⅱ、粉葛索氏提取Ⅲ的HPLC色谱图（略）　　2.1.2  对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品5.1mg，甲醇定容于25 ml量瓶。分别移取0.5，1.0，2.0，2.5 ml于5 ml量瓶，水定容，与原液共同作为HPLC用对照品溶液。　　2.1.3  供试品溶液的制备    　　热回流提取法：精密称取柴葛、粉葛粉末（过50目筛）各0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50 ml，称重。回流提取30 min，放冷，称重并以30%乙醇补足减失重量，摇匀过滤，取续滤液为供试品，待测。    　　索氏提取法：称取柴葛、粉葛粉末各0.5 g, 精密称定，以甲醇为提取剂提取4h，过滤，浓缩提取液并用甲醇定容于10 ml量瓶。超声处理30min，取上清液以水定容于10 ml量瓶，待测。　2.1.4  线性关系考察取对照品溶液，按照“2.1.1”色谱条件进样10 μl，葛根素进样量X(μg)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程为：Y= 3.507 6×106X + 3.274 5×104，r = 0.999 9。结果表明，葛根素进样量在0.204～2.04μg范围内与峰面积线性关系良好，可用外标两点法计算含量。　　2.1.5  精密度考察在“2.1.1”项色谱条件下，吸取同一对照品溶液10 μl，连续进样5次，测得峰面积，RSD=0.8%，表明进样与峰面积积分的精密度良好。　　2.1.6  重复性考察取同一批柴葛、粉葛样品5份，按“2.1.3”项下的方法制样后，以“2.1.1”项色谱条件进样10 μl，测定葛根素的峰面积，按外标法计算含量，RSD=2.8%，表明分析方法重复性良好。　　2.1.7  稳定性考察精密吸取对照品溶液10 μl，分别在0，1，2，4，8，12，24，48 h时进样，在 “2.1.1”项下色谱条件下测定峰面积，其RSD值为1.4%。表明葛根素在室内正常条件下48 h内稳定，因此整个实验过程可 μl，进样，计算回收率。结果见表1。  　　表1  加样回收率测定结果（略）　　2.1.9  样品测定按“供试品溶液制备”项下操作，制备各样品溶液，精密吸取10μl，进样，在所选色谱条件下测定，外标两点法计算含量，结果见表2。　　表2  样品中葛根素测定结果（略）　　2.2  紫外分光光度法测定葛根中总黄酮含量　　2.2.1  线性关系考察精密称取葛根素对照品5.1 mg，甲醇定容于25 ml量瓶。移取0.2，0.4，0.5，0.6，0.8 ml置于10 ml量瓶，水定容，为紫外测总黄酮用对照品溶液。    　　以溶液浓度为横坐标,吸收度为纵坐标，得线性方程：Y = 0.078X + 0.015 2，r=0.999 8。表明总黄酮浓度在4.08～16.32 μg/ml范围时与吸收度线性关系良好。　　图2  葛根素峰光谱扫描图谱（略）　　2.2.2  供试品制备    　　方法1：分别称取柴葛、粉葛4.5 g，置于圆底烧瓶，乙醇回流提取3次，40 ml/次，时间均为1 h。合并3次滤液并浓缩置25 ml量瓶，乙醇定容。取1 ml用乙醇定容于100量瓶，再取1 ml上清液于10 ml量瓶，水定容，待测。以1 ml乙醇加水定容于10 ml量瓶中为空白对照。方法2:取上述液相用索氏提取法制得的待测品0.4 ml，置于10 ml量瓶，水定容，待测。　　2.2.3  吸收波长考察与样品测定在200～800nm间紫外扫描浓度为8.16 μg/ml的葛根素对照品溶液，图谱如图2。在249～251nm处有最大吸收，选用250nm测定。分别测定两种方法制得4个样品。结果见表3。 　　表3  样品中总黄酮测定结果（略）　　3  讨论    　　HPLC法对不同产地的柴葛、粉葛中的葛根素的含量进行了测定，表明柴葛中葛根素含量约为粉葛的3倍，紫外测总黄酮含量表明，柴葛中葛根素量占总黄酮量的55%左右，粉葛中葛根素量占其总黄酮量的48%左右。同时比较了不同提取方法对葛根素和总黄酮含量测定的影响，发现回流提取法得到的葛根素含量较高，更有利于其提取，这与文献报道［3，4］一致。    　　在葛根素的提取中使用体积分数为30%的乙醇，是通过实验与参阅文献［5］得出的结果。此时总黄酮中的酚羟基主要以离子形式存在，HPLC色谱图为单峰，而使用60%乙醇提取时，总黄酮中酚羟基以离子与分子形式共存，色谱图为双峰。    　　葛根素HPLC图谱中葛根素峰易拖尾，分离度低，本文研究了甲醇：水不同配比对峰形、分离度和保留时间的影响，体积比为25∶75时葛根素峰拖尾，与后面的小峰分离度为1.3，体积比为35∶65时葛根素峰与前峰易重合。甲醇∶水比（V/V）为32∶68时，在样品分析中葛根素与其它峰均能达到基线分离，保留时间适中，柱效高，故选用为流动相。    　　此外，比较柴葛与粉葛的图谱，可发现其在葛根素及其它成分上均存在较大差别。图谱如图3。　　图3  柴葛与粉葛HPLC图谱的叠加（略）    　　本实验比较了不同提取方法对不同品种葛根中葛根素及总黄酮含量测定的影响，建立了HPLC法测定柴葛、粉葛中葛根素及UV法测其总黄酮含量的方法。方法学考察表明,该法准确、灵敏、简单、快速,可作为葛根中药材及饮片质量控制的方法之一。【参考文献】  　　［1］ 朱丽华,贺浪冲.葛根中有效部位及有效成分的高效液相色谱分析［J］.西安交通大学学报(医学版),2005,26(3)：216.

［2］ 张妤琳,梁敬钰.葛根素的研究进展［J］.海峡药学,2005,17(1):2.

［3］ 张梦军,吴世容,李志良.几种提取葛根异黄酮的方法比较及实验优化［J］.中成药,2005,27(10)：1133.

［4］ 赵浩如,郜凤香. 葛根总黄酮的提取方法研究［J］.中成药,2000,22(11)：756.

［5］ 张洪权，常爱武，吴拥军. 大别山野葛葛根素的高效液相色谱法测定［J］.郑州大学学报(医学版),2006,41(3)：580.